定量的プロテオミクスにより、イベルメクチンの幅広い抗ウイルス特性が明らかになり、COVID-19治療に有益であることが明らかになった。

定量的プロテオミクスにより、
イベルメクチンの幅広い抗ウイルス特性が明らかになり、
COVID-19治療に有益であることが明らかになった。

ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、コロナウイルス（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2[SARS-CoV-2]）などのウイルスは、世界中でヒトの健康に大きな負担をかけている。FDA認可の抗寄生虫薬であるイベルメクチンは、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗がん剤でもあり、世界的な公衆衛生を改善する可能性をより多く提供しており、in vitroでSARS-CoV-2の複製を効果的に阻害することができる。本研究では、ヒト卵巣がん細胞におけるイベルメクチン関連ウイルス感染経路の変化を明らかにすることを目的とした。Stable isotope labeling by amino acids in cell culture（SILAC）定量プロテオミクスを用いて、イベルメクチン（20μmol/L）を24時間投与したヒト卵巣がん細胞TOV-21Gと非投与のヒト卵巣がん細胞TOV-21Gを解析し、卵巣がん細胞におけるイベルメクチン関連タンパク質4447個を同定した。パスウェイネットワーク解析の結果、HCMV、HPV、EBV、HIV1感染経路を含む4つの統計的に有意な抗ウイルス経路が明らかになった。興味深いことに、GencLip3から報告された284のSARS-CoV-2/COVID-19関連遺伝子と比較すると、イベルメクチン投与時と非投与時で52のSARS-CoV-2/COVID-19関連タンパク質の変化が同定された。SARS-CoV-2/COVID-19関連遺伝子284個と、イベルメクチンによって制御されるSARS-CoV-2/COVID-19関連タンパク質52個の相互作用に基づいて、タンパク質-タンパク質ネットワーク（PPI）を構築した。PPIネットワークの分子複合体検出解析により、サイトカインと成長因子ファミリー、MAPキナーゼとGタンパク質ファミリー、HLAクラスタンパク質を含む3つのハブモジュールが同定された。Gene Ontology解析により、統計的に有意な10の細胞成分、13の分子機能、11の生物学的プロセスが明らかになった。これらの知見は、イベルメクチンの広範な抗ウイルス特性が、ウイルス関連疾患における予測、予防、個別化医療の文脈において、COVID-19治療に有益であることを示している。

1. 本研究は、ヒト細胞におけるイベルメクチン関連のウイルス感染経路変化を同定することを目的とした。

2. 定量的プロテオミクスにより、イベルメクチン関連タンパク質が、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、ヒト免疫不全ウイルス1（HIV1）、COVID-19感染経路を含む4つの抗ウイルス経路に統計学的に有意に関与していることが明らかになった。

3. 3.重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）/COVID-19に関連する52のタンパク質の変化を、イベルメクチン投与時と非投与時に同定し、これらのタンパク質はサイトカインと成長因子ファミリー、MAPキナーゼとGタンパク質ファミリー、HLAクラスタンパク質に関与していた。

4. これらの知見は、イベルメクチンの広範な抗ウイルス特性が、ウイルス関連疾患における予測、予防、個別化医療の文脈で、COVID-19治療に有益であることを示している。

1. はじめに

大村は1973年に、イベルメクチンを産生するユニークで驚異的な微生物を発見した（Burgら、1979年）。その後、イベルメクチンはヒトの健康に対して高い安全性と有効性を示したため、商品化された。イベルメクチンの現状は、科学者を驚かせ、興奮させ続けていた（Laing, Gillan, & Devaney, 2017）。イベルメクチンはもともと広域抗寄生虫薬であり、オンコセルカ症、ストロンギロイド症、リンパ系フィラリア症、疥癬を獣医学および人体医学的に治療することを目的としていた（Chabala et al.）イベルメクチンの優れた利点は、30年以上にわたってイベルメクチンを単剤で投与しているヒト集団においても、寄生虫に薬剤耐性が確認されなかったり、薬剤耐性の増加がみられなかったことである（van Wyk & Malan, 1988）。メカニズム的には、イベルメクチンの主な標的はグルタミン酸ゲートのクロライドチャネルである（Abdeltawabら、2020）。しかし、イベルメクチンは免疫防御機構と密接に関係し、宿主の免疫を回避する寄生虫の能力を抑制する免疫調節剤のように作用すると考えられるようになってきた（Schallerら、2017）。今日、イベルメクチンの新たな使用により、イベルメクチンは比較的知られていない薬剤となった。薬剤の再利用と再配置は、まったく新しい範囲の疾患を制御することが示されている（Ashour, 2019）。例えば、眼窩筋炎、トリチノーシス、マラリア、リーシュマニア症、アフリカトリパノソーマ症、喘息、てんかん、神経疾患、抗ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス［HIV］、デング熱、脳炎；Yang et al、 2020）、抗菌（結核、ブルーリ潰瘍；Csókaら、2018）、抗がん（乳がん、白血病、膠芽腫、子宮頸がん、胃がん、卵巣がん、大腸がん、黒色腫、肺がん；Crump、2017）。多面的な「驚異」であるイベルメクチンは、将来さらに優れた薬になるかもしれない。国際特許「イベルメクチンおよびその誘導体の使用」は、当時、イベルメクチンに対する人々の関心を高めていた。イベルメクチンは、代謝関連疾患（糖尿病、高コレステロール血症、インスリン抵抗性、肥満、高トリグリセリド血症、高血糖）、フェミソイドX受容体を介する疾患（動脈硬化、非アルコール性脂肪性肝疾患、胆汁うっ滞、胆石）、炎症、がんなどに使用するために開発されるだろう（Crump, 2017）。

HIV、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、新型重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）などのウイルスは、世界的にヒトの健康にとって大きな負担となっている。例えば、HIV-1感染者は全世界で3700万人近くおり、毎年100万人近くの患者がヒト免疫不全ウイルス感染と後天性免疫不全症候群（AIDS）関連疾患で死亡している（Huynh & Gulick, 2020）。HIVは免疫系にダメージを与え、CD4細胞を主に死滅させるため、患者は肺炎、サイトメガロウイルス、クリプトコッカス髄膜炎、結核、クリプトスポリジウム症、口腔鵞口瘡、トキソプラズマ症、がん（カポジ肉腫、リンパ腫；Nash & Robertson, 2019）などの様々な病気にかかりやすくなる。HCMVはβヘルペスウイルスであり、ヒト集団内での有病率は55％～100％である。HCMVは、西洋世界では、すべての出生児（1％～2.5％）において最も一般的な感染症の1つである（Buxmann, Hamprecht, Meyer-Wittkopf, & Friese, 2017）。HCMVの子宮内感染は、視覚障害、低出生体重、難聴、さまざまな程度の精神遅滞、肝脾腫、小頭症などの先天性異常を引き起こす可能性がある（Zavattoni et al.） HCMVはヒトの免疫反応を回避するさまざまなメカニズムを獲得した（Britt, 2008）。例えば、HCMVはウイルスUL16とUL142タンパク質によってNK細胞の活性を阻止した。HCMVはIL-10のウイルスホモログを獲得し、抗サイトメガロウイルス免疫を抑制した（Holder & Grant, 2019）。HCMVはまた、ウイルスUS11、US2、US3タンパク質による抗原処理と提示を防ぐために、主要組織適合性複合体の発現をダウンレギュレートした（Britt, 2008）。HCMVはまた、感染細胞のアポトーシスを防ぐタンパク質（UL36とUL37）を進化させ、宿主内でのHCMVの播種を促進した（Andoniou & Degli-Esposti, 2006）。EBVは単核球症を引き起こすヘルペスウイルスの仲間である。多くの人が無症候性感染であったが、EBVとバーキットリンパ腫などの他のリンパ増殖性疾患（非悪性、前悪性、悪性疾患）との潜在的な関連が広く研究された（Rezk, Zhao, & Weiss, 2018）、ホジキンリンパ腫、血球貪食性リンパ組織球症、胃がん、中枢神経系リンパ腫、急性小脳失調症（Nussinovitch, Prais, Volovitz, Shapiro, & Amir, 2003）、上咽頭がん、毛様白板症（Marques-Piubelli et al. , 2020). EBVは様々な細胞に感染するが、B細胞と上皮細胞に好んで感染する。B細胞膜融合はgHgL gp42の3つの部分からなる糖タンパク質複合体によって媒介されるが、上皮細胞膜融合はgHgLの2つの部分からなる複合体によって媒介される（Shannon-Lowe, Rowe, 2014）。HPVの約90％は無症状感染であったが、HPV感染はイボや前癌病変を引き起こす。HPV、特にHPV16とHPV18の亜型に感染した部位は、子宮頸部、膣、外陰部、口、陰茎、咽頭、肛門など、がんのリスクが高い（Athanasiou et al.） HPVは非統合エピソームとDNAへの統合で癌を引き起こすと考えられていた。HPV遺伝子の一部（E6およびE7）は、がん遺伝子として作用し、悪性化を促進した（Hoppe-Seyler, Bossler, Braun, Herrmann, & Hoppe-Seyler, 2018）。E6タンパク質はp53タンパク質と結合し、p53の不活性化をもたらした（Almeida, Queiroz, Sousa, & Sousa, 2019）。E7は形質転換タンパク質として働き、転写因子E2Fへの結合をめぐって網膜芽細胞腫タンパク質（pRb）と競合し、細胞周期を前進させた（Almeida et al.） SARS-CoV-2はコロナウイルス病2019（COVID-19）の発生につながり、急速に世界的大流行へと発展した。科学者たちはCOVID-19の治療法の開発に着手したが、この深刻な課題を解決するための抗SARS-CoV-2薬やワクチンは承認されていない（H. Li et al.）全世界では、700万人以上がSARS-CoV-2に感染しており、国家レベルでは40万人以上が死亡している（Lai, Shih, Ko, Tang, & Hsueh, 2020）。ウイルス感染に対抗する最も安全で効果的な方法を開発するためのさらなる研究が急務であった。イベルメクチンは、多くのウイルスによる感染を抑えることが実証されており、幅広いスペクトラム活性を持つ可能性がある（Yang et al.）例えば、イベルメクチンは、インポーティンα/β核内インポートに依存する抗HIV-1が報告されている（Wagstaff, Sivakumaran, Heaton, Harrich, & Jans, 2012）。イベルメクチンは、PAK-1活性の阻害を通じて、MAPK経路の活性化を抑える可能性がある。高含量スクリーニングにより、イベルメクチンはEBV陽性およびEBV陰性の上咽頭がん細胞に対する有望な薬剤であることも同定された（Gallardo, Mariamé, Gence, & Tilkin-Mariamé, 2018）。男性のHPVによって引き起こされる性器ヘルペスや感染症には、経口イベルメクチンが有効な治療選択肢となるかもしれないが、現在まで正式には承認されていない（Buechner, 2002）。さらに重要なことに、イベルメクチンはSARS-CoV-2の阻害剤として報告されており、SARS-CoV-2に感染した細胞に1回添加するだけで、ウイルスRNAを〜5000倍減少させる効果があった（Caly, Druce, Catton, Jans, & Wagstaff, 2020）。

ウイルスは依然として、最も解明されていない病原体のひとつである。メカニズムや宿主と寄生虫の相互作用に関する知識が不足しているため、シェディングの開発には限界がある。イベルメクチンは、入手の難しさ、生産コストの高さ、突然変異の確率の高さ、抵抗性の多さなど、いくつかの面で困難に直面している。イベルメクチンは、抗寄生虫、抗がん、抗菌、抗ウイルス剤として、世界の公衆衛生を改善する可能性がある。本研究では、イベルメクチン関連のプロテオミクスプロファイリングと分子ネットワークの変化を明らかにするために、安定同位体標識細胞培養アミノ酸（SILAC）定量プロテオミクス解析を用いた。我々は、HCMV感染、HPV感染、EBV感染、HIV1感染などのウイルス関連経路に注目した。さらに興味深いことに、同定されたタンパク質の多くがSARS-CoV-2/COVID-19と関連していることが報告された。これらの結果から、イベルメクチンは幅広い抗ウイルス薬である可能性が示された。SILAC定量プロテオミクスは、ウイルス関連経路におけるイベルメクチンの分子メカニズムを証明した。さらに、SARS-CoV-2関連タンパク質のタンパク質間相互作用（PPI）ベースのハブモジュールは、COVID-19の予測、予防、個別化医療（PPPM）の文脈で、COVID-19疾患の重要な分子を発見した。

2. 材料と方法

2.1. SILAC処理細胞

ヒト卵巣細胞株（TOV-21G；Keibai Academy of Science、南京、中国）を、2種類のSILAC試薬（Thermo Fisher Scientific）で培養した（1つは、100 mg/L l-lysine-2HClおよび100 mg/L l-arginine-HCl［「ライト」標識試薬＝L］および10％ウシ胎児血清［FBS］を補充したl-リジン［K］およびl-アルギニン［R］を含まないRPMI 1640培地であった； Gibco]、もう一つはl-リジン[K]とl-アルギニン[R]を含まないRPMI1640培地に100mg/L l-リジン-2HCl[13C6,15N2]と100mg/L l-アルギニン-HCl[13C6,15N4]を添加したものである["重い "標識試薬＝H； [13C6,15N2]は残基Kで8質量単位増加、[13C6,15N4]は残基Rで10質量単位増加を意味する]および10％FBS)を添加し、5％CO2、37℃で維持し、培地を2日ごとに更新した。培養細胞への安定同位体の完全な取り込みを確実にするため、12C14N（light = L）および13C15N（heavy = H）標識アミノ酸を用いたSILAC試薬で合計10継代処理した。

2.2. SILAC標識細胞のイベルメクチン処理
我々の以前の研究で、TOV-21G細胞をイベルメクチン（0～60μM）で24時間処理した場合、イベルメクチンのIC50は22.54μMであり、また20μMのイベルメクチン（IC50 22.54μMより小さい）はTOV-21Gの細胞増殖と遊走を有意に抑制し、TOV-21G細胞を良好な状態に維持することが判明した（N. Li & Zhan, 2020）。そこで、H-およびL-安定同位体標識培地で培養したTOV-21G細胞を、ジメチルスルホキシド（DMSO）中20μMのイベルメクチン、またはコントロールと同量のDMSOで24時間処理した。イベルメクチン処理したTOV-21G細胞を遠心分離（800g）し、PBSで洗浄（×3）した後、タンパク質単離バッファー［7M尿素、2mMチオ尿素、4％CHAPS（3-[(3-コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパン）、100mMジチオスレイトール（DTT）、2％両性溶媒］にボルテックス（×5）で懸濁（30分、4℃）した。抽出されたタンパク質溶液を遠心分離した（13,000g、20分、4℃）。上清を抽出タンパク質サンプルとし、そのタンパク質濃度を2-D quant kitで調べた。

2.3. SILAC標識効率解析
抽出したタンパク質サンプルを超音波処理し、遠心分離した（14,000g、25℃、40分）。H-およびL-安定同位体標識タンパク質を等しく混合し（1:1）、12.5%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE；20μg/lane；定電流14mA、90分）で分離し、クマシーブリリアントブルーで染色した。SDS-PAGEで分離したタンパク質は、還元、アルキル化、トリプシンによる消化、質量分析（MS）による同定を行った。タンパク質へのSILAC-同位体の組み込み効率は、Rappsilberの方法（Rappsilber, Ishihama, & Mann, 2003）を用いて推定した。本研究では、SILAC標識効率は最大97%であった。

2.4. タンパク質消化およびLC-分画
抽出したタンパク質サンプルを最終濃度 100 mM DTT で処理し、沸騰させ（水浴；5 分）、0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 中の 8 M 尿素 200 μl とともに 10 kD の限外ろ過遠心チューブに移し、遠心した（14,000 g, 15 分；×2）。限外ろ過遠心チューブ中のタンパク質サンプルを、0.05 M ヨードアセトアミド、8 M 尿素、0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 の溶液 100 μl で処理（暗室、30 分、室温）した後、遠心分離した（14,000g, 15 分）。ヨードアセトアミド処理したタンパク質サンプルを、0.1 M Tris-HCl, pH 8.5中8 M尿素100 μlで処理し、遠心分離（14,000g, 15分; ×3）した後、25 mM NH4HCO3溶液100 μlで処理し、遠心分離（14,000g, 15分; ×3）した。処理したタンパク質サンプルを40μlの100mM NH4HCO3中の2μgのトリプシン40μlと混合（600rpm、1分間振盪）し、振盪、静置（37℃、16-18時間）し、遠心分離（14,000g、15分間）のために新しい収集管に移し、次いで40μlの25mM NH4HCO3と混合し、遠心分離（14,000g、15分間）して、濾液をトリプシンペプチド混合物として収集した。ペプチド含量を定量した（OD280）。液体クロマトグラフィー（LC）を用いて、トリプシンペプチド混合物を逆LC-タンデム質量分析（LC-MS／MS）分析用の15個のペプチド画分に分画した。

2.5. LC-MS/MS
各ペプチド画分を、Q Exactive質量分析計（Thermo Fisher Scientific）と組み合わせたEasy nLC（Proxeon Biosystems、現Thermo Fisher Scientific）で60分間LC-MS/MS分析に供した。得られたMS/MSスペクトルデータを用いて、MaxQuantソフトウェアでタンパク質の同定と定量を行い、タンパク質データベースと照合した。軽アイソトープと重アイソトープの強度を用いて、イベルメクチンで処理した（重標識＝H）TOV-21G細胞と処理しない（軽標識＝L）TOV-21G細胞の間で発現量の異なるタンパク質を決定した。

2.6. バイオインフォマティクスと統計解析
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)パスウェイ解析をclusterProfiler (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html; Yu, Wang, Han, & He, 2012)を用いて行い、同定されたタンパク質に基づくシグナル伝達経路を見出した（p < .05、および調整p < .05）。報告されたSARS-CoV-2関連遺伝子はGenCLiP3 (http://ci.smu.edu.cn/genclip3/; Wang et al., 2019)で検索した。Cytoscape ClueGO (Bindea et al., 2009)を用いて、同定されたタンパク質から濃縮された生物学的プロセス(BPs)、分子機能(MFs)、細胞成分(CCs)を明らかにした（両側超幾何検定、Benjamini-Hochbergで補正した調整後p < .05）。報告されたSARS-CoV-2関連遺伝子は、STRING 10.0 (http://string-db.org/cgi/input.pl; Szklarczyk et al., 2015)により、PPIネットワーク構築のためのパラメータ（共発現スコア＞0.700）の信頼度で解析された。次に、PPI全体をCytoscapeソフトウェア（バージョン3.2.1; National Resource for Network Biology）を用いて分子複合体検出（MCODE; Bader & Hogue, 2003）で解析し、ハブモジュール（スコア＞6）を得た。統計的有意性はp < .05とした。Benjamini-Hochbergを用いて、パスウェイ内のタンパク質間の関連性の確率をp値で調整した。

3. 結果

3.1. SILAC定量プロテオミクス解析により、イベルメクチンの幅広い抗ウイルス特性が明らかになった。

SILACベースの定量プロテオミクスにより、イベルメクチンを投与した卵巣がん細胞と投与していない卵巣がん細胞で、合計4447個のイベルメクチン関連タンパク質が同定された（表S1）。さらにKEGGパスウェイ解析を行った結果、HCMV（図S1A）、HPV（図S1B）、EBV（図S1C）、HIV1（図S1D）感染経路を含む4つのウイルス関連経路（表1）と、8つの細菌関連経路（表1）が明らかになった、上皮細胞への細菌侵入、ビブリオコレラ感染、ヘリコバクター・ピロリ感染における上皮細胞シグナル伝達、病原性大腸菌感染、赤痢、サルモネラ感染、レジオネラ症、エルシニア感染などであった（図S2）。これらの濃縮されたパスウェイは、イベルメクチンが抗菌・抗ウイルス剤であることを示し、イベルメクチンの関連メカニズムを解明する手がかりとなった。

3.2. イベルメクチンによって制御されるSARS-CoV-2関連タンパク質
報告されているSARS-CoV-2関連遺伝子をGenCLiP3で検索し、284のSARS-CoV-2関連遺伝子をまとめた（表S2）。さらに、52のSARS-CoV-2関連タンパク質がイベルメクチンによって制御された（表2）。その中には、AKT1、ALB、ANPEP、APOE、APP、ATG5、B2M、BSG、CASP3、CAV1、CDC42、COL4A2、COPB2、CTSB、EEF1A2、EGFR、G6PD、HLA-A、HMGB1、 hspa4、idh2、ifitm3、il18、itch、itpa、kpna2、kpnb1、lims1、mapk1、mapk14、mapk8、mb、mgmt、mtor、nfkb1、pak1、 PARP1、PML、PPP1CA、PRKAA1、RB1、SARS、SARS2、SLTM、STAT1、TGFB1、TIMM8A、TRPV1、UBL5、ZC3HAV1、HMOX1、IL1F10。これらのイベルメクチン制御SARS-CoV-2関連タンパク質には、正常TOV-21G群（SILAC: L）と比較して、イベルメクチン処理TOV-21G群（SILAC: H）で存在量が減少した50のタンパク質が含まれる： SILAC定量プロテオミクスで同定された、存在量比（H/L）＜1のイベルメクチン処理TOV-21G群（SILAC：H）と正常TOV-21G群（SILAC：L）と比較して存在量が増加し、存在量比（H/L）＞1の2つのタンパク質（HMOX1およびIL1F10）。

共発現スコアが0.7以上のタンパク質間相互作用分子を選択し、SARS-CoV-2関連遺伝子284個のPPIネットワークを構築した（図1aおよび表S3）。PPIネットワーク全体をMCODEを用いてさらに解析したところ、3つのモジュールが見つかった（モジュール1スコア＝18、モジュール2スコア＝11、モジュール3スコア＝7；図1b-d）。これらのハブ分子は、SARS-CoV-2の根底にある重要な分子メカニズムの理解を深めるのに役立った。ハブモジュール1は主にサイトカインと成長因子ファミリーに関与しており、20のハブ分子IL1B、IL1A、IL18、CCL2、CCL3、IL13、CCL4、CXCL8、CCL5、TNF、IL10、IL7、IL5、CSF2、CSF3、TLR2、IFNG、CXCL10、IL4、IL17Aが含まれる。ハブモジュール2は、主にMAPキナーゼファミリーとGタンパク質ファミリーに関与しており、23のハブ分子MAPK14、MAPK3、VEGFA、AGT、AGTR2、MAPK1、IL6R、STAT1、MAPK8、P2RY12、JUN、KNG1、JAK1、EGFR、JAK2、CRP、PTGS2、HMOX1、C3、IL6、TLR4、IL2、SAA1が含まれる。ハブモジュール3は主にHLAクラスタンパク質に関与しており、7つのハブ分子HLA-A、HLA-DRB1、B2M、NCAM1、PML、HLA-DPB1、HLA-Eが含まれていた。さらに、イベルメクチンによって制御される52のSARS-CoV-2関連タンパク質もPPIネットワークを構築するために用いられた（図1e）。いくつかの重要な分子は、増殖と成長（MAPK1、MAPK14、MAPK8、EGFR、PAK1）、オートファジー（AKT1、MTOR、ATG5）、炎症（IL18、IL1F10、STAT1、TGFB1、NFKB1）において重要な役割を果たしていることがよく知られていた。これらのイベルメクチンが制御するSARS-CoV-2関連タンパク質が、PPIネットワークの中心に位置していることに注目すべきである。

3.3. イベルメクチンによって制御される52のSARS-CoV-2関連タンパク質の細胞内プロセスの変化
イベルメクチンによって制御されるSARS-CoV-2関連タンパク質のGene Ontology（GO）濃縮解析では、11の統計的に有意なBP、10の細胞成分（CC）、13のMFを含む多くの細胞プロセスの変化が得られた（図2および表S4）。BP解析の結果、多くのSARS-COV-2関連タンパク質は、タンパク質の輸入、活性酸素種の代謝過程の制御、筋肉細胞の増殖、結合の正の制御、宿主との相互作用、リポ多糖に対する細胞応答、金属イオンに対する細胞応答、細胞内タンパク質輸送の正の制御、骨髄細胞の恒常性、多くの細胞の恒常性、赤血球の恒常性において濃縮されていた（図2a）。CC解析では、多くのSARS-CoV-2関連タンパク質が、カベオラ、初期エンドソーム膜、特異的顆粒内腔、血小板α顆粒、血小板α顆粒内腔、フィコリン-1に富む顆粒、フィコリン-1に富む顆粒内腔、エンドソーム内腔、COPIIでコートされた小胞体からゴルジ体への輸送小胞、および食細胞小胞膜に濃縮されていることが示された（図2b）。MF解析によると、多くのSARS-CoV-2関連タンパク質は、リンタンパク質結合、タンパク質結合の負の調節、脂質キナーゼ活性、脂質キナーゼ活性の調節、結合の正の調節、タンパク質結合の正の調節、DNA結合の調節、DNA結合の正の調節、酸化還元酵素活性の調節、酸化還元酵素活性、モノオキシゲナーゼ活性の調節、一酸化窒素合成酵素活性、一酸化窒素合成酵素活性の調節に濃縮されていた（図2c）。

図2
機能およびパスウェイの濃縮解析。(a)52個のイベルメクチン制御SARS-CoV-2関連タンパク質の生物学的プロセス濃縮解析。(b)イベルメクチンによって制御されたSARS-CoV-2関連タンパク質52個の細胞成分濃縮解析。(c)52個のイベルメクチン制御SARS-CoV-2関連タンパク質の分子機能濃縮解析。Benjamini-Hochberg法で補正したp値＜0.05の遺伝子セットのみが有意とみなされた。p値が小さく、有意に濃縮されているものほど、ノードのサイズが大きい。同じ色は同じ機能グループを示す。各グループの中で、最も有意な項とラグを強調した代表的なものを選んだ。SARS-CoV-2, 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型

3.4. SARS-CoV-2に関連する52のイベルメクチン制御タンパク質の、ウイルス関連パスウェイ間での重複性
イベルメクチンによって制御されたSARS-CoV-2関連タンパク質のウイルス関連パスウェイ上での重複をベン図によって構築したところ（図3aおよび表S5）、これら5つのグループ（EBV、HCMV、HIV、HPV、SARS-CoV-2）の中で、HLA-A、AKT1、NFKB1、CASP3を含む4つのイベルメクチンによって制御されたSARS-CoV-2関連タンパク質が同定された。SILAC定量プロテオミクス解析により、イベルメクチンの広範な抗ウイルス特性が明らかになったため、ウイルス関連経路の中でイベルメクチンが制御するSARS-CoV-2関連タンパク質の重複をさらに研究することが重要かもしれない。現在、SARS-CoV-2の重要性から、SARS-CoV-2関連タンパク質として、ZC3HAV1、ITPA、ALB、COPB2、IL1F10、KPNB1、SLTM、 HMOX1、CTSB、IDH2、LIMS1、G6PD、UBL5、TGFB1、PML、IFITM3、CAV1、SARS、ITCH、MGMT、ATG5、HSPA4、SARS2、KPNA2、PRKAA1、ANPEP、APP、MB、BSG、TRPV1、IL18、TIMM8A、PPP1CA、HMGB1、APOE、PARP1、EEF1A2などである。

図3
イベルメクチンによって制御されたSARS-CoV-2関連タンパク質のウイルス関連経路と染色体上の位置との重複解析。(a)ウイルス関連パスウェイ間のイベルメクチン制御SARS-CoV-2関連タンパク質の重複をベン図により構築した。(b) イベルメクチンによって制御された52のSARS-CoV-2関連タンパク質のタンパク質発現に対応する染色体位置。EBV、エプスタイン・バーウイルス；HCMV、ヒトサイトメガロウイルス；HPV、ヒトパピローマウイルス；SARS-CoV-2、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2

イベルメクチンによって制御されたSARS-CoV-2関連タンパク質の発現に対応する染色体位置をプロットした。これらの5つのグループ（EBV、HCMV、HIV、HPV、SARS-CoV-2）の中で同定された4つのイベルメクチン制御SARS-CoV-2関連タンパク質は異なる染色体に局在しており、HLA-Aは第6染色体に、AKT1は第14染色体に、NFKB1とCASP3は第4染色体に局在していた（図3b、表S6）。

4. 考察
イベルメクチンは、長い間、抗寄生虫薬として、高度に発達した動物において非常に安全であることが証明されてきた。その主なメカニズムは、無脊椎動物（低発達動物）において神経伝達を遮断するグルタミン酸とγ-アミノ酪酸の塩化物依存性チャネルを標的とするためである。ヒトでは血液脳関門が存在し、中枢神経系を十分に保護することができる（Develoux, 2004）。イベルメクチンが薬剤耐性を引き起こすことはほとんどなく、副作用のほとんどはイベルメクチンそのものではなく、抗原の放出に関連したものであった（Boussinesq, 2005）。イベルメクチンの良好な耐性は、小児や乳児でも示された。合計170人の幼児と小児（体重15kg未満）にイベルメクチンを経口投与したところ、軽度な有害事象が報告されたのは7人だけで、重篤なものではなかった（Levyら、2020年）。妊婦のイベルメクチン曝露後の重篤な事象（死産、自然流産、新生児死亡、先天異常）についての既存のエビデンスを評価したところ、妊娠した893人の女性から低出生体重児、新生児死亡、早産、母体の罹患の報告はなく、イベルメクチンの高い安全性が示されたが、妊娠中のイベルメクチンの確実な安全性を結論づけるにはまだ不十分であった（Nicolas et al.）抗寄生虫薬イベルメクチンの薬物動態に関する研究では、他の疾患でイベルメクチンを使用する際に参考となる、いくつかの基準値が示された。被験者（n＝68）は、現在ヒトへの使用が承認されている用量（FDAが承認しているイベルメクチンの最高用量は200μg/kg）よりも高用量または高頻度で投与された。その結果、イベルメクチンはFDA認可の最高用量の10倍（2000μg/kg）であっても一般的に忍容性が高く、中枢神経系毒性を伴うことはほとんどないことが示された。さらに、平均曲線下面積比は30mg投与で1.24、60mg投与で1.40であり、イベルメクチンの蓄積は最小限であった（Guzzo et al.）多くの患者がイベルメクチンを投与されたことから、イベルメクチンは安全で忍容性の高い薬剤であることが示された。このことは、イベルメクチンが臨床応用において大きな価値を持つ可能性を高めた。

イベルメクチンは将来の抗ウイルス剤開発の基礎になると考えられ、イベルメクチンの広範な抗ウイルス活性として多くの研究が報告されている。例えば、イベルメクチンはチクングニアウイルスRNAの合成を減少させ、ウイルスタンパク質の発現をダウンレギュレーションし、ウイルスの感染サイクルに影響を与えた（Varghese et al.）イベルメクチンは核輸送阻害作用を有し、ハイスループット・スクリーニングにより、インポーティンα/β核内インポートの広域阻害剤であることが証明された。さらに、イベルメクチンはHIV-1とデングウイルスの複製を阻害することができた（Wagstaffら、2012年）。また、ある研究では、イベルメクチン投与が、ウイルスDNA合成と子孫ウイルス産生を用量依存的に阻害することにより、仮性狂犬病ウイルス感染を阻害することが示された。この過程で、核局在化シグナル経路を標的とすることにより、UL42の核局在化もイベルメクチンによって影響を受けた（Lvら、2018）。本研究では、KEGGパスウェイ解析により、HCMV、HPV、EBV、HIV1感染経路を含む4つのウイルス関連経路が示された。これら4つのイベルメクチン制御ウイルス関連パスウェイには、合計362個のタンパク質が含まれていた。これらのタンパク質の多くは、ウイルス感染の結果と密接に関連していた。NFKBは、紫外線照射、酸化フリーラジカル、サイトカイン、細菌やウイルス産物など、様々な細胞内外の刺激によって活性化される転写制御因子である。単純ヘルペスウイルスのE3ユビキチンリガーゼであるICP0タンパク質は、NF-κBのp65およびp50サブユニットと結合することで、腫瘍壊死因子α（TNF-α）が仲介する核因子κB（NF-κB）の活性化を有意に抑制し、このことが単純ヘルペスウイルスの病因や免疫回避に寄与している可能性がある（J. Zhang, Wang, & Zheng, 2013）。DDX58は、RNAヘリカーゼ-DEADボックスタンパク質モチーフとカスパーゼリクルートメントドメインを含むタンパク質をコードする。DDX58は、免疫応答のウイルス制御と二本鎖RNA認識に関与している。さらに、DDX58は他の宿主由来遺伝子やI型インターフェロンの転写誘導を仲介し、免疫病理の変化をもたらす（Rehwinkel & Gack, 2020）。EIF2AK2はセリン／スレオニンプロテインキナーゼをコードしており、dsRNAとの結合後、自己リン酸化によって活性化される。コードされたタンパク質の活性化型は翻訳開始因子EIF2S1をリン酸化し、その結果タンパク質合成が阻害される。EIF2AK2は、I型インターフェロン刺激遺伝子の一つとして、重要な生物学的および免疫学的機能を示した。ウイルス感染では、EIF2AK2はウイルス複製を阻害または促進した（Weiら、2020）。HCMV感染経路に関しては、合計85のイベルメクチン関連タンパク質が同定されている。そのうちのいくつかは、これまでの研究でイベルメクチンが介在していることが報告されている。例えば、イベルメクチンはミトコンドリアのカルシウムイオン過負荷、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種の発生を消失させることにより、上皮細胞のアポトーシスを誘導した。メカニズム的アプローチとして、イベルメクチンはAKT、PI3K、MAPK経路を含む細胞シグナル伝達経路を制御した（Lee et al.）イベルメクチンはまた、CCND1およびCDK4のダウンレギュレーションを介してG1期の細胞周期停止を制御し、細胞増殖を阻害した（Diao et al.） HPV感染経路に関しては、合計107種類のイベルメクチン関連タンパク質が同定されている。同定された関連タンパク質のいくつかは、これまでの研究でイベルメクチンが介在することが報告されている。例えば、イベルメクチンはBCL-2発現のダウンレギュレーション、BAX発現、切断ポリ［ADP-リボース］ポリメラーゼ、CASP3活性のアップレギュレーションによってアポトーシスを誘導した（Deng, Xu, Long, & Xie, 2018）。イベルメクチンは、P糖タンパク質活性を直接阻害するのではなく、EGFRの細胞外ドメインと結合してEGFRの活性化とその下流のシグナル伝達を阻害することにより、P糖タンパク質の転写を低下させた（Jiang, Wang, Sun, & Wu, 2019）。EBV感染経路に関しては、合計79のイベルメクチン関連タンパク質が同定されている。そのうちのいくつかは、以前の研究でイベルメクチンによって媒介されることが報告されている。例えば、イベルメクチンは、LPSで細胞を刺激した後、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK8）のリン酸化を阻害することにより、一酸化窒素合成酵素およびシクロオキシゲナーゼ-2酵素を阻害することが証明された（X. Zhang et al.）イベルメクチンは、特定のエピジェネティック制御因子SIN3Aを含むマルチターゲットと相互作用することから、抗寄生虫薬から、再配置された抗菌薬、抗ウイルス薬、抗がん薬になる可能性がある（Juarez, Schcolnik-Cabrera, & Dueñas-Gonzalez, 2018）。HIV1感染経路に関しては、合計91のイベルメクチン関連タンパク質が同定されている。そのうちのいくつかは、これまでの研究でイベルメクチンが介在していることが報告されている。例えば、イベルメクチンによるオートファジー誘導は、ユビキチン化を介した分解経路を介したP21活性化キナーゼ1（PAK1）の発現低下と関連していた（Dou et al.）

SARS-CoV-2の発生と大流行により、世界中がこの公衆衛生上の緊急事態を懸念している。疫学的研究によると、SARS-CoV-2は伝播速度が速く、予防措置をとらない場合、1回の感染で1.4～3.9人の新規感染者が出ると推定されている（Benvenuto et al.）このウイルスは主に密接な接触や呼吸器飛沫を介して伝播する。多くの研究者が、SARS-CoV-2がアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）という受容体に結合してヒトの細胞に侵入することを証明した（Letko, Marzi, & Munster, 2020）。FDA認可の抗寄生虫薬であるイベルメクチンは、SARS-CoV-2の阻害剤として最近の研究で何度も報告されている（Caly et al.）イベルメクチンは、インポーティン（IMPα/β1）を阻害し、酸性環境を作り出すことによって、ウイルスのインポートを媒介する（Caly et al.） Calyらは、SARS-CoV-2のRNA量において、イベルメクチン投与群（5μMイベルメクチン）と対照群の間で5000倍の減少が見られたと報告している。SARS-CoV-2に対するイベルメクチンのIC50は約2.5μMと計算された。健康なボランティアを対象とした以前の薬物動態学的研究によると、イベルメクチンの単回投与量は120mgまでで、安全かつ忍容性が高いことが示唆された（Chaccour, Hammann, Ramón-García, & Rabinovich, 2020）。最近の研究では、定量的トランスラトミクスとSILACベースのプロテオミクスにより、ヒト結腸上皮がん細胞株におけるSARS-CoV-2感染に対する細胞応答のシグナル伝達経路プロファイルが同定され、解糖、翻訳、スプライシング、プロテオスタシス、ヌクレオチド合成が含まれた（Bojkova et al.）本研究では、ヒト卵巣がん細胞株TOV-21Gの解析にSILACを用いた。興味深いことに、GencLip3（n = 284）から報告されたSARS-CoV-2/COVID-19関連遺伝子と比較すると、イベルメクチンを投与した場合と投与しなかった場合で、52個のSARS-CoV-2/COVID-19関連タンパク質の変化が同定された。例えば、CD147（BSG）がコードするタンパク質も免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、前駆細胞／幹細胞への直接的なウイルス侵入の可能性はCD147（BSG; Ulrich & Pillat, 2020）を介して報告されていた。RB1は細胞周期の負の制御因子であり、最初に発見された癌抑制遺伝子であった。SARS-CoV-1との構造相同性から、SARS-CoV-2はpRbを直接障害する可能性が示唆された。SARS-CoV-2による卓越した炎症反応と強い酸化ストレスを考慮すると、SARS-CoV-2が高い発癌リスクと関連するかどうかは、長期間観察する必要がある（Alpalhão, Ferreira, & Filipe, 2020）。SARS-CoV感染患者では、IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α、TGF-β1など、炎症性サイトカインの発現レベルの上昇が、急性肺障害と病態形成に密接に関連していた（He et al.）我々のデータはまた、イベルメクチンがTNFB1、IL18、IL1F10のような、SARS-CoV-2誘発サイトカインストームにおける主要なインターロイキンを制御することを同定した。イベルメクチンは、新型コロナウイルス感染に対して作用する可能性があるようであった。我々は、SARS-CoV-2感染の治療に使用されるイベルメクチンのメカニズムを提供した。

5. 結論
本研究は、我々の知る限り、SILAC定量プロテオミクス解析によってイベルメクチンが制御するウイルス関連経路を初めて明らかにしたものであり、イベルメクチンの広範な抗ウイルス特性を明らかにした。さらにエキサイティングなことは、同定されたイベルメクチン制御タンパク質の中には、報告されているSARS-CoV-2関連タンパク質も含まれており、SARS-CoV-2感染症の治療における潜在的なイベルメクチン関連バイオマーカーや新規メカニズムの開発に役立つ可能性があることである。イベルメクチンと他の薬剤を併用することで、COVID-19患者の予後がより良好になる可能性がある。たとえば、ある研究では、ヒドロキシクロロキンとイベルメクチンの併用が、COVID-19の治療に結果的かつ相乗的な作用を示すかもしれないと仮定している（Patrì & Fabbrocini, 2020）。今回の結果は、SARS-CoV-2感染の治療に用いられるイベルメクチンの分子メカニズムを理解するための指針になると期待される。さらに、今回の研究結果は、PPPMの研究と実践の文脈において、COVID-19の治療の選択肢としてイベルメクチンを開発するための知見を提供するものである。